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    高保真DNA聚合酶究竟有哪些魔力呢?

    發(fā)布時間: 2021-09-26  點擊次數(shù): 3014次

    作用原理

    高保真DNA聚合酶含有聚合中心和酶切中心[1],聚合中心具有5’-3’聚合酶活性,負責聚合作用;酶切中心具有3’-5’外切酶活性(也稱校對活性),負責將不配對的核苷酸予以切除。

    在PCR擴增過程中,當引物與模板*互補后,進入聚合中心,在聚合酶活性作用下,游離的脫氧核苷酸通過互補配對原則,依次結(jié)合到引物的3’端,新鏈DNA從5’到3’進行延伸(圖1-a);當引物末端結(jié)合的核苷酸與模板不配對時(圖1-b),錯配的核苷酸會翹起,新鏈DNA無法繼續(xù)向前延伸,進而進入酶切中心,在外切酶活性作用下,錯配的核苷酸會被切除(圖1-c);切除后此位點會重新結(jié)合正確的核苷酸,新鏈DNA又能繼續(xù)從5’到3’進行延伸(圖1-d),最終使新鏈DNA能夠進行精準復制[1-2]。

    高保真DNA聚合酶究竟有哪些魔力呢?

    圖1. 高保真DNA聚合酶工作原理示意圖[1-2]


    應用方向

    基因功能研究

    案例:研究表明A基因可能參與擬南芥中花青素的代謝,為了驗證這一假設(shè),要先將A基因從擬南芥中擴增出來,構(gòu)建到過表達或抑制表達載體上,通過農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)入擬南芥中,使A基因在擬南芥體內(nèi)過表達或抑制表達,最后通過形態(tài)指標、生理指標及基因表達水平等來判定這一假設(shè)是否成立。


    基因測序

    案例:若想探究擬南芥中B蛋白家族中不同基因的異同點,需要先將B蛋白家族中的所有基因從擬南芥中擴增出來,得到這些基因的堿基序列,然后通過生物信息學分析來初步分析它們的異同點。

    以上研究均需借助PCR技術(shù)將目的基因從物種中精準擴增出來,如果擴增出的基因序列出現(xiàn)突變,那么后續(xù)分析都會不準確;為了保證目的基因的精準擴增,我們在PCR擴增過程中就需要使用高保真DNA聚合酶。


    此外,高保真DNA聚合酶也可以用于基因型鑒定。

    答疑劇場
    問Q1:高保真DNA聚合酶擴增產(chǎn)物為平末端,后續(xù)做TA克隆,如何在產(chǎn)物末端加A?

    答:反應體系:10 µl

    ①單酶:1 µl 10×Taq Buffer(MgCl2 Plus),0.5 µl dNTP Mix (10 mM),0.2 µl Taq DNA Polymerase,1-7 µl純化后PCR片段,ddH2O補齊至10 µl


    ②Mix:5 μl 2×Taq Master Mix,1-5 µl純化后PCR片段,ddH2O補齊至10 µl
    反應程序:72℃,10 min



    問Q2:高保真酶DNA聚合酶擴增的片段一定不會突變嗎?

    答:高保真DNA聚合酶具有3’-5’的外切酶活性,在PCR擴增過程中可降低核苷酸錯配的概率,保真度越高的DNA聚合酶,核苷酸錯配的概率就會越低,但不表示擴增過程中絕對不會發(fā)生核苷酸的錯配。因此,為了提高實驗的成功率,建議同一樣本挑取多個(>3個)單克隆進行測序。



    問Q3:不同公司高保真DNA聚合酶的保真度有可比性嗎?

    答:高保真酶的保真度通常表示為是Taq酶的幾倍,常見的保真度測定方法有:藍白斑篩選測定、一代測序和NGS測序等。不同品牌DNA聚合酶的保真度測定方法不同,若想要比較不同品牌DNA聚合酶的保真度,必須采用相同的保真度測定方法,進行平行比對。


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    參考文獻:

    [1] 黎景光. DNA聚合酶高保真原理應用于SNP檢測的研究[D]. 暨南大學, 2006.

    [2] Steitz TA. DNA polymerases: structural diversity and common mechanisms. J Biol Chem, 1999, 274(25): 17395–17398.



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